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Ringraziamo la Dott.ssa Paola Melotti e il Dott. Valentino Bezzerri per aver redatto e condiviso con noi questa relazione. ‘Non lasciare nessuno senza cura per ogni difetto di base’ è stato il sentire comune di questo Congresso: una speranza che anche noi come comunità di pazienti e familiari ci sentiamo di supportare con grande passione.

 

La North American Cystic Fibrosis Conference 2022 è il più grande evento scientifico annuale interamente dedicato alla Fibrosi Cistica (FC). Normalmente il congresso richiama oltre 4000 ricercatori da tutto il mondo e prevede un vasto numero di sessioni parallele divise in base agli argomenti trattati (infiammazione, nuove terapie, aspetti immunologici, problemi gastrointestinali ecc.). La conferenza è incentrata sia sugli aspetti clinici che sulla ricerca di base, quasi in ugual misura. Visto che stiamo vivendo l’era dei nuovi farmaci modulatori del canale CFTR, definiti anche HEMT (Highly Effective Modulator Therapy), la maggior parte degli interventi ha trattato i diversi aspetti di queste nuove terapie.

Ecco un riassunto delle comunicazioni maggiormente significative:

1. Effetto di HEMT sull’infiammazione e sulle infezioni nel polmone FC. Un dato interessante emerso dagli studi di follow-up sui pazienti trattati con HEMT, in particolare con Kaftrio (triplice terapia contenente Ivacaftor, Lumacaftor ed Elexacaftor), è che queste terapie, oltre ad aumentare significativamente la funzione respiratoria dei pazienti con FC, sono in grado di ridurre il numero dei comuni ceppi batterici patogeni associati alla malattia riscontrati nell’espettorato. La composizione di quest’ultimo infatti, si modifica sia in seguito al trattamento con Kaftrio (nei pazienti con mutazione F508del), sia in seguito alla terapia con Kalydeco (Ivacaftor, per pazienti con mutazioni di “gating”, es. G551D).

Tuttavia, i ceppi batterici anaerobi non risentono del trattamento con HEMT. La possibile spiegazione a questo fenomeno potrebbe risiedere nella diversa modalità di ingresso nell’organismo da parte dei batteri aerobi (che necessitano di ossigeno per sopravvivere), rispetto ai batteri anaerobi (che non necessitano ossigeno). Infatti, i primi entrano nell’organismo attraverso l’aria che si respira, mentre i secondi invadono l’organismo attraverso il cavo orale. La diversa localizzazione potrebbe quindi fornire un elemento discriminante per capire l’effetto antibatterico degli HEMT osservato nei pazienti.

È bene sottolineare che pochissimi pazienti si negativizzano alle infezioni batteriche polmonari dopo trattamento con HEMT. Su 49 pazienti positivi a P. aeruginosa trattati con HEMT, solo 5 sono risultati negativi al batterio dopo un anno di terapia. In modo analogo, su 83 pazienti positivi a S. aureus, solo 3 hanno riportato negativizzazione completa dopo HEMT. Queste terapie, quindi, non riescono generalmente a debellare le infezioni. Probabilmente i batteri permangono nelle zone dove il polmone è più danneggiato, anche se si è visto che le terapie con i nuovi modulatori producono un incremento di clearance polmonare (eliminazione dei patogeni dalla superficie dell’epitelio tramite il battito ciliare) del tutto simile in polmoni moderatamente danneggiati così come in polmoni gravemente danneggiati. Ulteriori studi cercheranno di fare maggior luce su questi aspetti.

Riguardo all’effetto anti-infiammatorio delle terapie con HEMT, si è visto che i modulatori della CFTR sono in grado di ridurre drasticamente la quantità di elastasi neutrofilica (NE) nel polmone. Questo fenomeno è verosimilmente associato alla riduzione della carica batterica e al conseguente minore richiamo di granulociti neutrofili, i globuli bianchi preposti alla rimozione dei batteri patogeni, che sono la principale sorgente di NE. Tuttavia, i dati riportano ancora che l’infiammazione generale del polmone permane, seppur diminuita, dopo terapia con HEMT. Questo è probabilmente dovuto all’infezione batterica che permane dopo la terapia, ma non si esclude che vi possano essere altri meccanismi molecolari in grado di spiegare la patogenesi dell’infiammazione polmonare FC.

Durante le esacerbazioni polmonari, la principale sorgente di carbonio per i batteri è lo zucchero, tramite il processo della fermentazione, che provoca la riduzione del pH nel lume bronchiale. Viceversa, durante le fasi di “climax”, caratterizzata da un minore numero di batteri patogeni nel polmone, associata ad un minor grado di infiammazione, i batteri utilizzano gli aminoacidi come fonte di carbonio, tramite l’amminazione riduttiva, con la formazione di ammonio, che alcalinizza il pH. Gli studi di follow-up dopo un anno di terapia con HEMT hanno mostrato che i modulatori della CFTR (in particolare Kaftrio), modifica la composizione peptidica nel polmone, aumentando il numero di aminoacidi disponibili. Questo porta ad un microbioma e ad un metaboloma più dinamici (cambiano la composizione dei vari micronutrienti) dopo terapia con HEMT, favorendo la fase di climax rispetto alle fasi di esacerbazione.

Anche gli aspetti immunologici sono stati indagati post-trattamento con i modulatori della CFTR. In particolare, sembra che una particolare sottopopolazione di linfociti T, definiti CD3+ di memoria, venga modulata dalla terapia. Si sta quindi valutando il valore prognostico di tale modulazione leucocitaria.

Inoltre, gli studi condotti su pazienti con mutazioni di gating nel gene CFTR in trattamento con Kalydeco mostrano che c’è una notevole variabilità di effetto anti-infiammatorio del farmaco, sia tra coorti di pazienti diverse, che all’interno delle stesse coorti. Ciononostante, Kalydeco corregge il fenotipo anti-apoptotico dei neutrofili FC, rendendoli meno resistenti e riducendo i loro danni collaterali. Ancora più importante, studi ex vivo dimostrano che Kalydeco aumenta il killing batterico di questi globuli bianchi.

A livello di epitelio polmonare, si è visto che già dopo tre mesi di trattamento con Kaftrio il trascrittoma (la quantità di RNA messaggeri totali di una cellula) viene modificato nelle cellule basali (progenitori pluripotenti) e viene regolato positivamente il Notch signaling, importante per l’omeostasi cellulare. Dopo un anno di terapia si osserva anche una riduzione dei livelli di marker infiammatori quali IL-6, calprotectina e proteina C reattiva (PCR).

 

2. Nuovi modelli cellulari per lo screening di HEMT. Diversi studi hanno mostrato che le cellule indotte pluripotenti staminali (iPSC) costituiscono un valido strumento per lo screening di nuovi farmaci per la FC. Queste cellule possono essere differenziate sia in epiteli respiratori bidimensionali, che in organoidi (o meglio sferoidi) respiratori, mantenendo una buona espressione genetica del canale cloruro CFTR.

 

3. Nuovi approcci terapeutici per le mutazioni rare. Diverse comunicazioni hanno presentato dati sullo sviluppo di nuove terapie per le mutazioni rare FC, in particolare per le mutazioni nonsenso (es. W1282X, G542X ecc.). Le mutazioni nonsenso introducono un codone di stop prematuro (PTC) all’interno della sequenza codificante del RNA messaggero, portando all’interruzione della traduzione proteica e generando quindi proteine tronche. Inoltre, queste mutazioni possono indurre un meccanismo cellulare endogeno in grado di eliminare gli RNA mutati contenenti PTC, denominato nonsense mediated decay (NMD). Due diversi studi hanno mostrato che l’utilizzo di oligonucleotidi antisenso (ASO) in grado di legarsi al mRNA mutato di CFTR, promuovono la soppressione del PTC, generando uno splicing (maturazione del trascritto primario) alternativo. La proteina CFTR che ne deriva è più piccola, poiché perde una intera sequenza esonica (D23 o D24) relativa al dominio NBD2. Tuttavia, la proteina modificata rimane parzialmente responsiva agli attuali modulatori (Kaftrio). Un altro studio di gene editing in vitro ha mostrato che la strategia Adenine-Based Editing (ABE) si è mostrata efficace nel correggere la mutazione G542X, ripristinando il 10% di proteina CFTR corretta. Infine, i gruppi inglesi, da sempre attivi nel campo della terapia genica, hanno mostrato i loro interessanti ultimi sviluppi nel campo della terapia genica convenzionale. Il gene CFTR corretto viene veicolato nei loro modelli in vitro ed in vivo (topo) grazie ad un nuovo vettore virale derivato dalla combinazione tra lentivirus e Sendai virus. Nel topo, l’espressione di CFTR wild type (funzionale) permane per oltre due anni dopo una sola dose di agente virale, con scarsi eventi avversi. Alla luce di questi dati, la relatrice ha riferito che è in fase di lancio un trial clinico di fase II.

 

4. Nuovi dati dal modello suino FC. Uno studio comparativo tra fenotipo FC nel modello suino e nei pazienti ha mostrato che il difetto della circonferenza tracheale (irregolare e ristretta) è precoce nello sviluppo embrionale in entrambi i casi e avviene nel 15.5% dei casi ed è associato a maggior predisposizione all’infezione da P.aeruginosa. Il trattamento con Ivacaftor (Kalydeco) nei maiali con FC dal giorno 35 al giorno 114 dopo la nascita, sebbene ripristini la funzione del canale, non corregge il danno tracheale. Il modello suino ha fornito importanti dati sulla localizzazione della proteina CFTR durante la morfogenesi fetale. I canali CFTR si distribuiscono inizialmente in specifiche zone del bronco, sulle membrane apicali, a contatto con il lume. Non c’è alcuna espressione di CFTR nelle altre aree del bronco. Durante, lo sviluppo del feto, la localizzazione si distribuisce invece più uniformemente. Inoltre, la CFTR si distribuisce anche nella muscolatura liscia del polmone.

 

5. Localizzazione del canale CFTR negli epiteli respiratori FC. Sempre a riguardo della localizzazione di CFTR nel polmone, è stata condotta una vasta analisi in singola cellula. Da questo studio si è visto che poche cellule polmonari esprimono CFTR ad alti livelli. Le maggiori cellule esprimenti CFTR sono le cellule caliciformi mucipare e le Clara cells (oggi definite CLUB cells), oltre agli ionociti, che rappresentano però solo l’1% delle cellule polmonari.

 

6. Secrezione di muco in FC. Le possibili cause dell’elevata secrezione di muco sono essenzialmente 3:
   • La deidratazione delle vie aeree
   • La mancanza di bicarbonato nel lume
   • Le interazioni alterate tra diverse mucine (le proteine che costituiscono il muco)

In vitro, il muco si riesce a rimuovere facilmente con una serie di lavaggi con soluzioni saline da epiteli bronchiali bidimensionali che esprimono la CFTR funzionale. Viceversa, negli epiteli bronchiali FC il muco risulta estremamente appiccicoso e non si riesce a rimuovere con i normali lavaggi. Dopo HEMT, il muco si riesce invece a rimuovere anche dagli epiteli FC. Il trattamento con Kaftrio aumenta inoltre la clearance mucociliare in vitro.

 

7. Ridotta rigenerazione degli epiteli respiratori FC. Le cellule epiteliali bronchiali FC presentano una minore capacità rigenerativa in seguito a danno (wound healing test). Negli epiteli generati da colture primarie, le cellule basali FC (progenitori pluripotenti) mostrano una ridotta capacità proliferativa e un minor grado di differenziazione. Alcuni marker di senescenza, tra cui p53 e p21, sono over-espressi in queste cellule. Essendo la senescenza un processo irreversibile che induce arresto del ciclo cellulare ed arresto della proliferazione, è ipotizzabile che sia questa la spiegazione della ridotta capacità rigenerativa degli epiteli FC. È stato mostrato che il silenziamento genico di a-catenina aumenta il tasso di rigenerazione in cellule FC.

 

8. E’ stata fornita anche particolare attenzione a vari aspetti di consulenza genetica, inclusa la nomenclatura delle varianti del gene CFTR, alla genitorialità con riferimenti anche alle terapie con modulatori durante la gravidanza, ai casi complessi di diagnosi di fibrosi cistica o sue forme minori (patologie correlate a CFTR) o a situazioni in cui lo screening neonatale non risulta conclusivo con relativo follow-up dei casi definiti appunto Cystic Fibrosis Screen Positive Inconclusive Diagnosis (CFSPID). Contributi importanti in merito agli aggiornamenti sulla diagnosi di forme minori di fibrosi cistica, definite patologie correlate al gene CFTR sono arrivati da membri del gruppo di lavoro diagnostico della European Cystic Fibrosis Society a cui partecipano esperti internazionali che recentemente hanno pubblicato la standardizzazione delle procedure per le patologie correlate a CFTR, in particolare in merito ai criteri diagnostici del malfunzionamento della proteina CFTR.

 

9. I test per evidenziare il difettoso funzionamento di CFTR nei soggetti restano quelli da molti anni certificati a fini diagnostici: misurazione di potenziali nasali e correnti intestinali ma si stanno affiancando altri metodi ancora a livello sperimentale ma molto promettenti quali gli organoidi intestinali, le cui applicazioni diagnostiche si avvalgono del metodo Rectal Organoids Morphology Analysis (ROMA), il test del sudore beta adrenergico nelle sue due modalità di detezione ottica o con evaporimetro e l’analisi di cellule di epitelio respiratorio nasale ottenute mediante “nasal brushing”. Per ora non risultano ancora messe a punto le procedure per ottenere organoidi da epitelio respiratorio con tutte le possibilità sperimentali offerte dagli organoidi intestinali sviluppati da biopsie rettali, in particolare la disponibilità di espandere la disponibilità dei campioni, in particolare quando questi derivano da un unico o pochi soggetti come nel caso di mutazioni rare del gene CFTR. Sono stati forniti aggiornamenti in merito ai risultati dello studio Human Individualized Treatment for Cystic Fibrosis (HIT-CF, ww.hitcf.org) ottenuti dalla collaborazione di ricercatori belgi, olandesi e portoghesi utilizzando organoidi intestinali di più di 500 pazienti affetti da FC (di cui un centinaio sono italiani): questi sono stati suddividi in due gruppi in base alla presenza o meno di almeno una mutazione nonsenso. Sono state infatti valutate le risposte in termini di miglioramento della funzione CFTR negli organoidi intestinali a seguito del trattamento con potenziatori e correttori o agenti attivi su stop prematuro (che caratterizza le mutazioni nonsenso cioè stop) non ancora arrivati alla sperimentazione clinica. Le sperimentazioni cliniche si svolgeranno in una parte (15%) dei soggetti che hanno fornito le biopsie rettali e quindi i riscontri in organoidi intestinali: sarà molto interessante poter allora confrontare gli effetti clinici nei pazienti con questi dati presentati ottenuti in laboratorio: questo progetto europeo sta suscitando fin dall’inizio molto interesse a livello internazionale per la sua originalità, l’estensione dell’arruolamento dei pazienti e la rarità delle mutazioni che vengono valutate. Si tratta infatti di un approccio di medicina personalizzata per la quale è stata segnalata la crescente rilevanza in FC, soprattutto al fine di individuare farmaci modulatori di CFTR attivi auspicabilmente per tutti i pazienti affetti da FC.

 

10. Il motto condiviso fortemente da clinici e ricercatori di base che ha caratterizzato questo convegno, sicuramente anche nelle sessioni plenarie, è stato quello di non lasciare nessuno senza cura per il difetto di base. Quindi è risultata chiara la necessaria prospettiva di proseguire per individuare nuovi approcci per fornire molecole da far arrivare alla sperimentazione clinica. Essa non dovrà necessariamente seguire i consueti schemi visto che essi implicano l’arruolamento di numerosi pazienti ed invece le mutazioni ancora “orfane” di farmaci modulatori di CFTR sono quelle più rare di cui sono portatori pochi individui, talvolta singoli pazienti attualmente noti.

 

11. Nella sezione 3 sono state descritte specifiche strategie intraprese in laboratorio per mutazioni per le quali non sono indicati farmaci modulatori di CFTR già approvati per uso clinico in FC; per arrivare al paziente è stata già prevista anche la loro modalità di somministrazione: prevalentemente per inalazione come per le molecole oligonucleotidi antisenso, vettori virali e RNA. E’ stato affrontato anche il problema dell’alto costo dei modulatori CFTR attualmente in uso clinico che in alcuni Paesi crea una barriera critica per l’accesso di tutti alle cure, anche se già dimostrate essere efficaci sulle singole mutazioni. Una caratteristica molto accattivante di questo convegno è effettivamente la varietà degli ambiti su cui si focalizzano le varie sessioni ed i loro collegamenti altamente dinamici come si può cogliere di anno in anno. Un esempio è quello dello sviluppo dei metodi diagnostici che coincidono spesso con i metodi per il monitoraggio degli effetti dei farmaci modulatori di CFTR nei soggetti affetti da FC oppure delle conoscenze microbiologiche e patogenetiche della malattia sviluppate in modelli sperimentali che si vanno ulteriormente, e forse talvolta inaspettatamente, delineando valutando gli effetti dei farmaci modulatori di CFTR nei pazienti.

 

Per maggiori dettagli ed una visione completa di quanto avvenuto al NACFC 2022, si consiglia la lettura degli abstract del congresso, disponibili sulla rivista Journal of Cystic Fibrosis alla pagina web https://www.cysticfibrosisjournal.com/issue/S1569-1993(22)X0006-4